Awọn anfani:
- Agbara lati loye awọn imọran ti CRISPR, gRNA (RNA itọsọna), PAM ati awọn ipa ibi-afẹde ati ni oye itetisi atọwọda gbejade atokọ oludije gRNA ailewu ati koodu apẹrẹ
- Agbara lati rii daju tikalararẹ awọn oludije gRNA ti a fun nipasẹ oye atọwọda pẹlu awọn irinṣẹ itupalẹ ibi-afẹde ti iwé ati titete jiini
- Agbara lati gba awọn opin iṣe / biosafety ati pe apẹrẹ ko yẹ ki o ṣe imuse laisi ijẹrisi yàrá
CRISPR-Cas9 (eto atunṣe jiini ti o baamu lati awọn kokoro arun lati ge ati satunkọ DNA ni aaye ibi-afẹde) ti yi isedale molikula pada: o ṣee ṣe ni bayi lati yi aaye pato kan pato ninu jiini kan. Ṣugbọn agbara yii jẹ alaanu lodi si awọn aṣiṣe apẹrẹ: itọsọna ti ko tọ ti a yan RNA (gRNA - ọna kukuru ti RNA ti o ṣe itọsọna enzymu Cas si ibi-afẹde) le ge jiini ti ko tọ tabi ṣe awọn gige airotẹlẹ kuro ni ibi-afẹde. Ninu ẹyọ yii, iwọ yoo kọ ẹkọ bi o ṣe le lo itetisi atọwọda (AI) bi oluranlọwọ ninu apẹrẹ CRISPR, ṣiṣẹda ero, koodu kikọ, ati awọn aṣayan asọye; ṣugbọn iwọ yoo kọ idi ti o nilo lati fọwọsi yiyan gRNA ati itupalẹ ibi-afẹde pẹlu awọn irinṣẹ amọja ati idanwo.
Ikilọ to ṣe pataki: Maṣe beere taara AI “fun mi ni ilana gRNA fun jiini yii” ati pe maṣe lo ọna ti nwọle bi o ti jẹ. LLM le mu gRNA kan ti ko baramu ofin PAM (isalẹ) tabi ti o baamu ni ibomiiran ninu jiometirika, tabi paapaa gRNA ti a ṣe patapata. Ọna ti o tọ: Ṣiṣeto ilana apẹrẹ pẹlu AI, ti ipilẹṣẹ ati igbelewọn awọn oludije pẹlu awọn irinṣẹ apẹrẹ CRISPR pataki (bii CRISPOR, CHOPCHOP) ati rii daju wọn ni idanwo.
Awọn agbekale ipilẹ
- Cas9: Enzyme (molikula scissors) ti o ge DNA. O ṣẹda fifọ okun meji nibiti gRNA ṣe itọsọna.
- gRNA / sgRNA: Itọsọna ti o to 20 nucleotides ti o baamu DNA ibi-afẹde ati gbigbe Cas9 sibẹ.
- PAM (Protospacer Adjacent Motif): Ilana kukuru kan ti o gbọdọ wa ni ọtun lẹgbẹẹ ibi-afẹde fun Cas9 lati ge. Fun SpCas9 nigbagbogbo "NGG" (N jẹ ipilẹ eyikeyi).
- Iṣiṣẹ lori ibi-afẹde: bawo ni imunadoko gRNA ge ni ibi-afẹde (diwọn nipasẹ Dimegilio asọtẹlẹ).
- Pa-afojusun: gRNA di ati ge awọn aaye miiran ninu jiometirika ti o jọ ibi-afẹde; undesirable ati ki o lewu.
- HDR / NHEJ: Awọn ọna atunṣe sẹẹli lẹhin gige; NHEJ gbogbogbo fi awọn indels kekere silẹ, HDR ṣe awọn ayipada deede si awoṣe kan.
Igbese nipa igbese: AI-iranlọwọ CRISPR oniru sisan
1. Ṣe alaye ibi-afẹde ati idi. Jiini wo, kini exon, iru iyipada wo (knockout tabi atunse pipe)? Ẹya jiini to ni aabo ati tiransikiripiti.
2. Gba awọn jara lati gbẹkẹle orisun. Ṣe igbasilẹ ilana agbegbe ibi-afẹde lati Ensembl/NCBI; Maṣe jẹ ki AI ṣe akori rẹ.
3. Ṣe ina awọn oludije gRNA pẹlu ọpa aṣa. Awọn irinṣẹ bii CRISPOR/CHOPCHOP ṣayẹwo fun PAM, pese awọn ikun ibi-afẹde ati wa awọn ibi-afẹde-jakejado genom. Lo AI lati ṣe itumọ abajade ti awọn irinṣẹ wọnyi.
4. Ya si pa-afojusun ewu isẹ. Imukuro awọn oludije pẹlu awọn ikun ibi-afẹde giga; Jẹrisi pẹlu awọn irinṣẹ pupọ ni awọn ohun elo to ṣe pataki.
5. Gbero esiperimenta afọwọsi. Jẹrisi nipasẹ idanwo (atẹle-tẹle, T7E1, ipasẹ amplicon) boya gRNA ti o yan yoo ge ibi-afẹde naa (ati pipa-afojusun). Iwọn apẹrẹ jẹ iṣiro, kii ṣe ẹri.
Imọran: Ṣaaju lilo oludije gRNA kan, BLAST ọna rẹ lodi si genome lati rii ibiti o yatọ si ibi-afẹde ti o baamu ni deede tabi ni pẹkipẹki. Igbesẹ yii nikan yọkuro awọn oludije ibi-afẹde ti o lewu julọ ni kutukutu.
mẹta mini igba
Ọran 1 - gRNA laisi PAM. Ọmọ ile-iwe kan beere lọwọ AI fun gRNA fun jiini kan ati pe o gba ọkọọkan ironu ti awọn nucleotides 20. Sibẹsibẹ, ko si NGG PAM nitosi ibi-afẹde; Nitorina Cas9 ko le ge nibe. Nigbati ọmọ ile-iwe ti wọ agbegbe naa sinu CRISPOR, o rii pe ọpa naa daba awọn oludije to wulo pẹlu PAM. Ti o ba ti lo ọna AI, idanwo naa yoo kuna patapata.
Case 2 - Asiri pa-afojusun. Oniwadi kan fẹran “ipa-giga” gRNA ti a daba nipasẹ AI. Nigbati o sare CRISPOR lati ṣayẹwo fun ibi-afẹde, o rii pe gRNA baamu iyatọ ipilẹ 1 nikan ni jiini miiran - eewu pipa-afojusun pataki kan. Oludije ti a kuro. Laisi iṣiro iṣiro ibi-afẹde, apilẹṣẹ ti aifẹ le ge jade.
Irú 3 - Ìmúdájú gba. Yàrá kan ṣe akojọpọ awọn oludije gRNA mẹta ati idanwo wọn ninu awọn sẹẹli; Nipa ipasẹ amplicon, o rii pe ọkan nikan ni o ni diẹ sii ju 60% ṣiṣatunkọ (indels), lakoko ti awọn meji miiran ni labẹ 5%. Awọn ikun apẹrẹ fihan gbogbo awọn mẹta bi “dara”. Ijerisi idanwo ṣafihan iyatọ laarin asọtẹlẹ ati otitọ.
Apeere: Iṣakoso PAM ti oludije gRNA
gbe wọle tun # Gba ilana agbegbe ibi-afẹde lati Ensembl/NCBI; Maṣe jẹ ki AI ṣe akori rẹ. afojusun = "GACGTTGCATCGGATCCTAAGGCTTACGGTAGCTAGCTAGGCTAAGG"# 20 nt protospacer + NGG PAM àwárí fun SpCas9 (opin strand + strand) fun m ninu re.finditer(r"(?=([ACGT]{20}))([ACGT]GG))", ibi-afẹde ([ACGT]GG)) , pamup m.group(2) titẹ (f"Ipo {m.start()+1}: gRNA={protospacer} PAM={pam}")
Eyi yoo ṣe atokọ awọn oludije nikan pẹlu PAM ti o wulo; Ṣugbọn awọn irinṣẹ pataki ni a nilo fun iṣẹ ibi-afẹde ati ibi-afẹde. Koodu yii jẹ ohun elo iboju alakoko, kii ṣe apẹrẹ pipe.
Mẹrin daakọ awọn awoṣe
1) Ilana apẹrẹ (laisi ṣiṣejade lẹsẹsẹ):
Rẹ ipa: CRISPR oniru arannilọwọ. Ṣeto ilana apẹrẹ kan fun: [gene, exon, knockout/recision correction, genom version, transcript] .Ewo ọpa kan pato (CRISPOR/CHOPCHOP) pẹlu awọn eto wo ni MO yẹ ki o lo, eyiti o ṣe iṣiro (lori-afojusun, pipa-afojusun) yẹ ki Mo wo, sọ fun mi ni igbese nipasẹ igbese. Ti o npese gRNA ọkọọkan SEN; Emi yoo gbejade lati inu ọkọ.
2) Itumọ ibi-afẹde:
Ṣe alaye bii o ṣe yẹ ki MO ka awọn ọwọn ibi-afẹde ni iṣelọpọ CRISPOR: kini Dimegilio MIT, Dimegilio CFD, iṣiro aiṣedeede tumọ si, ni awọn iloro wo ni MO yẹ ki n mu oludije kuro? Ṣe awọn ẹnu-ọna yatọ si ni ile-iwosan ati awọn ohun elo iwadii?
3) Eto idaniloju idanwo:
Bawo ni MO ṣe le rii daju ni idanwo pe gRNA ti Mo ti yan awọn gige mejeeji lori ibi-afẹde ati pe ko si ibi-afẹde? T7E1, ṣe alaye itọsẹ amplicon (jin) ati igbesẹ apẹrẹ iṣakoso nipasẹ igbese, pẹlu iru awọn iṣakoso lati fi sii.
4) koodu iṣaju PAM/framework:
Kọ koodu Python kan ti o rii gbogbo awọn protospacers oludije 20 NT fun SpCas9 (NGG PAM) lori awọn okun mejeeji ni ọna ibi-afẹde ti a fun. Ijabọ ipo, okun ati PAM fun oludije kọọkan. Pato ninu asọye koodu pe eyi jẹ imukuro alakoko nikan ati pe ohun elo pataki kan nilo fun ibi-afẹde.
Ailagbara kiakia / Alagbara kiakia
Alailagbara: "Fun mi ni ilana CRISPR gRNA kan fun jiini MYC."
Isoro: Ko si ẹya genome/kikọsilẹ, ko si PAM ati iṣakoso ibi-afẹde, AI le funni ni iro tabi lewu ọkọọkan.
Alagbara: "Ṣeto ilana apẹrẹ CRISPR kan fun GRCh38, MYC (exon 2) knockout; sọ fun mi iru ọpa lati lo, pẹlu eto wo, ati ni ibi-afẹde ibi-afẹde lati yọkuro. Emi yoo ṣe ilana gRNA lati inu ọpa naa, iwọ ko gbejade. ”
Kini idi ti o fi lagbara: Ọrọ ti o han gbangba, apẹrẹ ti fi silẹ si ọpa kan pato, ibi-afẹde ati ijẹrisi ni a fi si aarin.
Ipele
Ipa ti AI
Ijẹrisi dandan
Ilana
Ṣe iṣeduro awọn ero ati awọn irinṣẹ
iwé agbeyewo
gRNA iṣelọpọ
Comments
CRISPOR/COPCHOP Dimegilio
Iṣakoso PAM
kọ koodu
Ṣiṣe koodu naa ki o jẹrisi
Pa-afojusun
kede Dimegilio
Ọkọ ayọkẹlẹ pataki + BLAST
Ipari
Comments
Esiperimenta lesese
Awọn aṣiṣe ti o wọpọ
- Lo taara lilo gRNA ti a fun nipasẹ AI. O le jẹ laisi PAM, ibi-afẹde tabi iro.
- Foju-itupalẹ ibi-afẹde. Aṣiṣe ti o lewu julọ; awọn Jiini ti a kofẹ le ge jade.
- Aṣiṣe aṣiṣe apẹrẹ fun ẹri idaniloju. Dimegilio jẹ asọtẹlẹ; gbọdọ rii daju ninu sẹẹli naa.
- Nlọ kuro ni ẹya genome/tiransikiripiti ti a ko pinnu. Exon ti ko tọ le jẹ ìfọkànsí.
- Gbẹkẹle ọkọ ayọkẹlẹ kan. Ni awọn ohun elo to ṣe pataki, ijẹrisi pẹlu awọn irinṣẹ lọpọlọpọ nilo.
Išọra: Ṣiṣatunṣe Gene fun eniyan tabi awọn idi ile-iwosan jẹ koko ọrọ si iwuwasi iwa ati awọn ilana ofin. Ẹyọ yii wa fun iwadii ati imọwe apẹrẹ; Awọn ipinnu adaṣe iṣe-iwosan nilo ifọwọsi igbimọ ihuwasi, ẹgbẹ iwé ati ofin. Iṣatunkọ Germline (jogun) jẹ eewọ ni ọpọlọpọ awọn orilẹ-ede.
Ijinle: ka awọn ikun ibi-afẹde ni nọmba
Ṣe iṣiro eewu ibi-afẹde pẹlu awọn ikun nja meji, kii ṣe awọn ọrọ aiduro bii “giga / kekere.” Dimegilio MIT (0-100) ṣe akopọ bawo ni gRNA kan pato ṣe jakejado-jinomii; Dimegilio giga (fun apẹẹrẹ 80+) tumọ si eewu ibi-afẹde ti o dinku. Dimegilio CFD (Ipinnu Igbohunsafẹfẹ gige, 0-1) ṣe iṣiro iṣeeṣe ti gige gangan agbegbe ibi-afẹde kọọkan ni ọkọọkan; Paapaa agbegbe ibi-afẹde kan loke 0.2 le ṣe imukuro oludije fun awọn ohun elo to ṣe pataki. Ṣe oye oye atọwọda ṣe alaye awọn ikun meji wọnyi, lẹhinna ka awọn iye gangan ninu iṣelọpọ ọkọ funrararẹ.
Apeere kan pato: ẹgbẹ kan n yan laarin awọn oludije meji. Oludije A ni Dimegilio MIT ti 91 ati ibi-afẹde CFD ti o ga julọ jẹ 0.05. Oludije B ni Dimegilio MIT ti 88 ṣugbọn o ni ibi-afẹde ẹyọkan ni exon ti jiini suppressor tumo pẹlu CFD kan ti 0.34. Botilẹjẹpe awọn ikun gbogbogbo han sunmọ, nibiti ibi-afẹde ti wa (ti ṣe koodu jiini to ṣe pataki ti iṣẹ) jẹ ki oludije B jẹ itẹwẹgba. O ṣe pataki lati ṣe iṣiro ibi-afẹde kii ṣe ni awọn ofin ti nọmba nikan ṣugbọn pẹlu pataki ti ẹda ti jiini ti o ṣubu lori.
Ojuami miiran: o jẹ eewu diẹ sii fun awọn aiṣedeede lati waye ni agbegbe “irugbin” ti o sunmọ PAM ju ni agbegbe ti o jinna; Paapaa iyatọ ipilẹ 1-2 ni agbegbe irugbin le da Cas9 duro, lakoko ti iyatọ ipilẹ 3-4 kuro lati PAM le farada. Nitorina, ipo rẹ jẹ pataki bi nọmba awọn iyatọ.
Dimegilio / ami iyasọtọ
Oṣu kejila
Ọrọìwòye
MIT pato
0-100
Ga = kekere pa-afojusun ewu
CFD (ibi-afẹde kan)
0-1
Ju 0.2 le yọkuro ni awọn ohun elo to ṣe pataki
Ipo ariyanjiyan
irugbin / latọna jijin
Agbegbe irugbin jẹ eewu diẹ sii
Ni akojọpọ
- AI ni apẹrẹ CRISPR; o jẹ oluranlọwọ ti o ṣe ilana, kọ koodu, ati ṣalaye awọn aṣayan, kii ṣe ohun elo ti o “ṣejade” gRNA.
- Awọn oludije gRNA gbọdọ jẹ iṣelọpọ pẹlu awọn irinṣẹ pataki (CRISPOR/CHOPCHOP), ati PAM ati ibi-afẹde gbọdọ jẹ iṣakoso nọmba.
- Iwọn apẹrẹ jẹ iṣiro; Oju ibi-afẹde ati ipa ibi-afẹde gbọdọ jẹ timo ni idanwo idanwo (titẹsisẹ).
- Awọn iṣe ile-iwosan ati awọn iṣe germline jẹ koko ọrọ si iwuwasi iwa / awọn opin ofin.
Ohun elo iṣẹ-ṣiṣe
Ṣe igbasilẹ agbegbe jiini ibi-afẹde lati Ensembl. Ṣiṣe koodu iboju-tẹlẹ PAM loke ki o ṣe atokọ awọn protospacers oludije. Lẹhinna gbejade agbegbe kanna si ohun elo bi CRISPOR ati gba ibi-afẹde ati awọn ikun ibi-afẹde; Ṣe afiwe awọn oludije koodu rẹ pẹlu awọn iṣeduro ọpa. Ṣe idanimọ oludije pẹlu eewu ibi-afẹde ti o ga julọ ki o kọ sinu gbolohun kan idi ti yoo fi parẹ kuro.
akojọ ayẹwo
- [] Mo ṣeto ibi-afẹde naa nipasẹ jiini, exon, ẹya genome ati tiransikiripiti.
- [] Mo gba jara naa lati orisun ti o gbẹkẹle, Emi ko ṣe akori nipasẹ AI.
- [] Mo ti ipilẹṣẹ ati ki o gba wọle gRNA oludije pẹlu aṣa ọpa.
- [] Mo ṣayẹwo wiwa PAM ati eewu ibi-afẹde.
- [] Mo ti ṣeto soke ohun esiperimenta ijerisi ètò.
- [] Mo mọ nipa iwa / awọn aala ofin ati pe mo ti ṣakiyesi ifọwọsi iwé.