กำไร:
- ความสามารถในการเข้าใจแนวคิดของ CRISPR, gRNA (guide RNA), PAM และผลกระทบนอกเป้าหมาย และให้ปัญญาประดิษฐ์สร้างรายชื่อผู้สมัคร gRNA ที่ปลอดภัยและโค้ดการออกแบบ
- ความสามารถในการตรวจสอบผู้สมัคร gRNA ที่ได้รับจากปัญญาประดิษฐ์เป็นการส่วนตัวด้วยเครื่องมือวิเคราะห์นอกเป้าหมายโดยผู้เชี่ยวชาญและการจัดตำแหน่งจีโนม
- ความสามารถในการยอมรับขีดจำกัดด้านจริยธรรม/ความปลอดภัยทางชีวภาพ และการออกแบบไม่ควรถูกนำไปใช้โดยไม่ได้รับการตรวจสอบจากห้องปฏิบัติการ
CRISPR-Cas9 (ระบบแก้ไขยีนที่ดัดแปลงจากแบคทีเรียเพื่อตัดและแก้ไข DNA ที่จุดเป้าหมาย) ได้เปลี่ยนแปลงชีววิทยาระดับโมเลกุล โดยขณะนี้สามารถเปลี่ยนจุดเฉพาะในยีนได้อย่างแม่นยำ แต่พลังนี้ไร้ความปราณีต่อข้อผิดพลาดในการออกแบบ: RNA นำทางที่เลือกไม่ถูกต้อง (gRNA ซึ่งเป็นลำดับสั้น ๆ ของ RNA ที่นำเอนไซม์ Cas ไปยังเป้าหมาย) สามารถตัดยีนที่ไม่ถูกต้องหรือตัดออกจากเป้าหมายโดยไม่ได้ตั้งใจ ในหน่วยนี้ คุณจะได้เรียนรู้วิธีใช้ปัญญาประดิษฐ์ (AI) เป็นตัวช่วยในการออกแบบ CRISPR การสร้างแผน การเขียนโค้ด และการอธิบายตัวเลือกต่างๆ แต่คุณจะได้เรียนรู้ว่าทำไมคุณจึงต้องตรวจสอบความถูกต้องของการเลือก gRNA และการวิเคราะห์นอกเป้าหมายด้วยเครื่องมือพิเศษและการทดลอง
คำเตือนที่สำคัญ: อย่าถาม AI โดยตรงว่า "ขอลำดับ gRNA สำหรับยีนนี้" และอย่าใช้ลำดับที่เข้ามาเหมือนเดิม LLM อาจให้ผล gRNA ที่ไม่ตรงกับกฎ PAM (ด้านล่าง) หรือที่ตรงกับส่วนอื่นๆ ในจีโนม หรือแม้แต่ gRNA ที่สร้างขึ้นใหม่ทั้งหมด วิธีที่ถูกต้อง: การสร้างกลยุทธ์การออกแบบด้วย AI การสร้างและให้คะแนนผู้สมัครด้วยเครื่องมือการออกแบบ CRISPR พิเศษ (เช่น CRISPOR, CHOPCHOP) และการตรวจสอบด้วยการทดลอง
แนวคิดพื้นฐาน
- Cas9: เอนไซม์ (กรรไกรโมเลกุล) ที่ตัด DNA มันสร้างการแตกของเกลียวคู่ตรงที่ gRNA ชี้นำ
- gRNA / sgRNA: แนวทางของนิวคลีโอไทด์ประมาณ 20 ตัวที่ตรงกับ DNA เป้าหมายและขนส่ง Cas9 ไปที่นั่น
- PAM (Protospacer Adjacent Motif): ลำดับสั้นๆ ที่ต้องอยู่ติดกับเป้าหมายเพื่อให้ Cas9 ตัด สำหรับ SpCas9 มักจะเป็น "NGG" (N คือฐานใดๆ ก็ตาม)
- ประสิทธิภาพตามเป้าหมาย: gRNA ตัดไปที่เป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิภาพเพียงใด (วัดจากคะแนนการคาดการณ์)
- นอกเป้าหมาย: gRNA ผูกและตัดจุดอื่นๆ ในจีโนมที่มีลักษณะคล้ายกับเป้าหมาย ที่ไม่พึงประสงค์และเป็นอันตราย
- HDR / NHEJ: เส้นทางการซ่อมแซมเซลล์หลังการตัด; โดยทั่วไป NHEJ จะทิ้งอินเดลเล็กๆ เอาไว้ ส่วน HDR จะทำการเปลี่ยนแปลงเทมเพลตอย่างแม่นยำ
ทีละขั้นตอน: ขั้นตอนการออกแบบ CRISPR ที่ได้รับความช่วยเหลือจาก AI
1. ชี้แจงเป้าหมายและวัตถุประสงค์ ยีนใด, เอ็กซอนใด, การเปลี่ยนแปลงประเภทใด (การแก้ไขที่น่าพิศวงหรือความแม่นยำ)? เวอร์ชันจีโนมและการถอดเสียงที่ปลอดภัย
2. รับซีรีส์จากแหล่งที่เชื่อถือได้ ดาวน์โหลดลำดับขอบเขตเป้าหมายจาก Ensembl/NCBI อย่าให้ AI จดจำมัน
3. สร้างผู้สมัคร gRNA ด้วยเครื่องมือที่กำหนดเอง เครื่องมือ เช่น CRISPOR/CHOPCHOP ตรวจสอบ PAM ให้คะแนนตามเป้าหมาย และค้นหานอกเป้าหมายทั้งจีโนม ใช้ AI เพื่อตีความผลลัพธ์ของเครื่องมือเหล่านี้
4. ยอมรับความเสี่ยงนอกเป้าหมายอย่างจริงจัง กำจัดผู้สมัครที่มีคะแนนนอกเป้าหมายสูง ยืนยันด้วยเครื่องมือที่หลากหลายในการใช้งานที่สำคัญ
5. วางแผนการตรวจสอบการทดลอง ยืนยันโดยการทดลอง (การจัดลำดับ, T7E1, การจัดลำดับแอมพลิคอน) ว่า gRNA ที่เลือกจะตัดเป้าหมายจริงหรือไม่ (และนอกเป้าหมาย) คะแนนการออกแบบเป็นเพียงการประมาณการ ไม่ใช่ข้อพิสูจน์
เคล็ดลับ: ก่อนที่จะใช้ตัวเลือก gRNA ให้ BLAST เรียงลำดับเทียบกับจีโนมเพื่อดูว่าที่อื่นนอกเหนือจากเป้าหมายที่ตรงหรือใกล้เคียงกัน ขั้นตอนนี้เพียงอย่างเดียวจะกำจัดผู้สมัครที่ไม่อยู่ในเป้าหมายที่อันตรายที่สุดตั้งแต่เนิ่นๆ
มินิเคสสามอัน
กรณีที่ 1 — gRNA ที่ไม่มี PAM นักเรียนคนหนึ่งถาม AI สำหรับ gRNA เพื่อหายีนและได้รับลำดับนิวคลีโอไทด์ 20 ตัวที่สมเหตุสมผล อย่างไรก็ตาม ไม่มี NGG PAM ใกล้เป้าหมาย ดังนั้น Cas9 จึงไม่สามารถตัดตรงนั้นได้ เมื่อนักเรียนเข้าสู่ภูมิภาคใน CRISPOR เขาเห็นว่าเครื่องมือแนะนำผู้สมัครที่ถูกต้องด้วย PAM หากใช้ลำดับของ AI การทดลองจะล้มเหลวโดยสิ้นเชิง
กรณีที่ 2 — นอกเป้าหมายที่เป็นความลับ นักวิจัยคนหนึ่งชอบ gRNA ที่ "มีประสิทธิภาพสูง" ที่แนะนำโดย AI เมื่อเขาเรียกใช้ CRISPOR เพื่อตรวจสอบเป้าหมายที่อยู่นอกเป้าหมาย เขาพบว่า gRNA ตรงกับความแตกต่างเบสเพียง 1 ยีนในยีนอื่น ซึ่งเป็นความเสี่ยงที่ร้ายแรงนอกเป้าหมาย ผู้สมัครถูกคัดออก หากไม่มีการวิเคราะห์นอกเป้าหมายเชิงตัวเลข ยีนที่ไม่ต้องการก็อาจถูกตัดออกได้
กรณีที่ 3 — ได้รับการยืนยัน ห้องปฏิบัติการแห่งหนึ่งสังเคราะห์ตัวเลือก gRNA สามคนและทดสอบพวกมันในเซลล์ จากการหาลำดับแอมพลิคอน เขาพบว่ามีเพียงตัวเดียวเท่านั้นที่มีการแก้ไขมากกว่า 60% (อินเดล) ในขณะที่อีกสองตัวมีน้อยกว่า 5% คะแนนการออกแบบแสดงให้เห็นว่าทั้งสามคะแนน "ดี" การตรวจสอบเชิงทดลองเผยให้เห็นความแตกต่างระหว่างการทำนายและความเป็นจริง
ตัวอย่าง: การควบคุม PAM ของผู้สมัคร gRNA
นำเข้าอีกครั้ง # รับลำดับภูมิภาคเป้าหมายจาก Ensembl/NCBI อย่าให้ AI จดจำมัน target = "GACGTTGCATCGGATCCTAAGGCTTACGGTAGCTAGCTAGGCTAAGG"# 20 nt protospacer + NGG PAM ค้นหา SpCas9 (ส่วนท้าย + สาระ) สำหรับ m ใน re.finditer(r"(?=([ACGT]{20})([ACGT]GG))", เป้าหมาย): protospacer, pam = m.group(1), m.group(2) พิมพ์ (f "ตำแหน่ง {m.start()+1}: gRNA={protospacer} PAM={pam}")
นี่จะแสดงเฉพาะผู้สมัครที่มี PAM ที่ถูกต้องเท่านั้น แต่จำเป็นต้องมีเครื่องมือพิเศษสำหรับกิจกรรมตามเป้าหมายและนอกเป้าหมาย รหัสนี้เป็นเครื่องมือคัดกรองเบื้องต้น ไม่ใช่การออกแบบที่สมบูรณ์
เทมเพลตที่สามารถคัดลอกได้สี่แบบ
1) กลยุทธ์การออกแบบ (โดยไม่ต้องสร้างซีรีส์):
บทบาทของคุณ: ผู้ช่วยออกแบบ CRISPR สร้างกลยุทธ์การออกแบบสำหรับ:[ยีน, เอ็กซอน, การแก้ไขน็อคเอาท์/ความแม่นยำ, เวอร์ชันจีโนม, การถอดเสียง] เครื่องมือเฉพาะใด (CRISPOR/CHOPCHOP) พร้อมการตั้งค่าใดที่ฉันควรใช้ คะแนนใด (ตามเป้าหมาย นอกเป้าหมาย) ฉันควรดู และบอกฉันทีละขั้นตอน การสร้างลำดับ gRNA SEN; ฉันจะผลิตมันจากยานพาหนะ
2) การตีความนอกเป้าหมาย:
อธิบายว่าฉันควรอ่านคอลัมน์นอกเป้าหมายในเอาต์พุต CRISPOR ได้อย่างไร: คะแนน MIT, คะแนน CFD, จำนวนที่ไม่ตรงกันหมายถึงอะไร ฉันควรกำจัดผู้สมัครตามเกณฑ์ใด เกณฑ์ขั้นต่ำในการใช้งานทางคลินิกและการวิจัยแตกต่างกันหรือไม่?
3) แผนการตรวจสอบการทดลอง:
ฉันจะตรวจสอบเชิงทดลองได้อย่างไรว่า gRNA ที่ฉันเลือกทั้งการตัดตามเป้าหมายและไม่ได้อยู่นอกเป้าหมาย T7E1 อธิบายการจัดลำดับแอมพลิฟายเออร์ (เชิงลึก) และการออกแบบการควบคุมทีละขั้นตอน รวมถึงตัวควบคุมที่จะใส่
4) รหัสคุณสมบัติเบื้องต้นของ PAM/กรอบงาน:
เขียนโค้ด Python ที่จะค้นหาโปรโตสเปเซอร์ที่เป็นตัวเลือก 20 nt ทั้งหมดสำหรับ SpCas9 (NGG PAM) บนทั้งสองเส้นในลำดับเป้าหมายที่กำหนด รายงานตำแหน่ง กระทู้ และ PAM สำหรับผู้สมัครแต่ละคน ระบุในความคิดเห็นของโค้ดว่านี่เป็นเพียงการกำจัดเบื้องต้นเท่านั้น และจำเป็นต้องใช้เครื่องมือพิเศษสำหรับนอกเป้าหมาย
พรอมต์อ่อน / พรอมต์แรง
จุดอ่อน: "ขอลำดับ CRISPR gRNA สำหรับยีน MYC ให้ฉันหน่อย"
ปัญหา: ไม่มีเวอร์ชัน/การถอดเสียงจีโนม ไม่มี PAM และการควบคุมนอกเป้าหมาย AI อาจให้ลำดับปลอมหรือเป็นอันตราย
แข็งแกร่ง: "ตั้งค่ากลยุทธ์การออกแบบ CRISPR สำหรับ GRCh38, MYC (exon 2) น็อคเอาต์ บอกฉันหน่อยว่าควรใช้เครื่องมือใด การตั้งค่าใด และกำจัดออกจากเกณฑ์นอกเป้าหมายเท่าใด ฉันจะสร้างลำดับ gRNA จากเครื่องมือ คุณไม่ได้สร้างมันขึ้นมา"
ทำไมจึงมีประสิทธิภาพ: บริบทชัดเจน การออกแบบตกเป็นของเครื่องมือเฉพาะ นอกเป้าหมาย และการตรวจสอบเป็นศูนย์กลาง
เวที
บทบาทของเอไอ
การตรวจสอบภาคบังคับ
กลยุทธ์
แนะนำแผนและเครื่องมือ
ความคิดเห็นของผู้เชี่ยวชาญ
การผลิตจีอาร์เอ็นเอ
ความคิดเห็น
คะแนน CRISPOR/CHOPCHOP
การควบคุมแพม
เขียนโค้ด
เรียกใช้รหัสและยืนยัน
นอกเป้าหมาย
ประกาศคะแนน
ยานพาหนะพิเศษ + BLAST
บทสรุป
ความคิดเห็น
ลำดับการทดลอง
ข้อผิดพลาดทั่วไป
- ใช้ gRNA โดยตรงที่ AI มอบให้ อาจปราศจาก PAM นอกเป้าหมาย หรือของปลอม
- ข้ามการวิเคราะห์นอกเป้าหมาย ความผิดพลาดที่อันตรายที่สุด สามารถตัดยีนที่ไม่ต้องการออกได้
- เข้าใจผิดว่าคะแนนการออกแบบเป็นหลักฐานเชิงประจักษ์ คะแนนเป็นการทำนาย จะต้องได้รับการตรวจสอบในเซลล์
- ปล่อยให้เวอร์ชันจีโนม/การถอดเสียงไม่ได้รับการระบุ Exon ที่ไม่ถูกต้องอาจถูกกำหนดเป้าหมาย
- พึ่งรถคันเดียว.. ในการใช้งานที่สำคัญ จำเป็นต้องมีการยืนยันด้วยเครื่องมือหลายอย่าง
ข้อควรระวัง: การตัดต่อยีนเพื่อวัตถุประสงค์ของมนุษย์หรือทางคลินิกอยู่ภายใต้กฎระเบียบด้านจริยธรรมและกฎหมายที่เข้มงวด หน่วยนี้มีไว้สำหรับความรู้ด้านการวิจัยและการออกแบบ การตัดสินใจในการปฏิบัติงานทางคลินิกต้องได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรม ทีมผู้เชี่ยวชาญ และกฎหมาย การแก้ไข Germline (สืบทอดมา) เป็นสิ่งต้องห้ามในหลายประเทศ
ความลึก: อ่านคะแนนนอกเป้าหมายเป็นตัวเลข
ประเมินความเสี่ยงที่ไม่ตรงเป้าหมายด้วยคะแนนที่เป็นรูปธรรมสองคะแนน ไม่ใช่คำที่คลุมเครือ เช่น "สูง/ต่ำ" คะแนน MIT (0-100) สรุปความเฉพาะเจาะจงของ gRNA ทั่วทั้งจีโนม คะแนนสูง (เช่น 80+) หมายถึงความเสี่ยงนอกเป้าหมายน้อยลง คะแนน CFD (การกำหนดความถี่การตัด 0-1) จะประมาณความน่าจะเป็นของการตัดแต่ละพื้นที่นอกเป้าหมายจริงทีละรายการ แม้แต่ภูมิภาคนอกเป้าหมายเดียวที่สูงกว่า 0.2 ก็สามารถกำจัดตัวเลือกสำหรับแอปพลิเคชันที่สำคัญได้ ให้ปัญญาประดิษฐ์อธิบายคะแนนทั้งสองนี้ จากนั้นอ่านค่าจริงในเอาต์พุตของยานพาหนะด้วยตนเอง
ตัวอย่างที่เป็นรูปธรรม: ทีมหนึ่งกำลังเลือกระหว่างผู้สมัครสองคน ผู้สมัคร A มีคะแนน MIT อยู่ที่ 91 และ CFD นอกเป้าหมายสูงสุดคือ 0.05 ผู้สมัคร B มีคะแนน MIT 88 แต่มีเป้าหมายนอกเป้าหมายเดียวในเอ็กซอนของยีนต้านเนื้องอกที่มี CFD 0.34 แม้ว่าคะแนนโดยรวมจะดูใกล้เคียงกัน แต่โดยที่นอกเป้าหมาย (การเข้ารหัสยีนที่สำคัญเชิงฟังก์ชัน) ทำให้ผู้สมัคร B ไม่สามารถยอมรับได้ เป็นสิ่งสำคัญในการประเมินนอกเป้าหมายไม่เพียงแต่ในแง่ของจำนวน แต่ยังรวมถึงความสำคัญทางชีวภาพของยีนที่ตกอยู่ด้วย
อีกประเด็นหนึ่ง: การไม่ตรงกันเกิดขึ้นในภูมิภาค "เมล็ดพันธุ์" ใกล้กับ PAM มีความเสี่ยงมากกว่าในภูมิภาคห่างไกล แม้แต่ความแตกต่างเบส 1-2 ในบริเวณเมล็ดก็สามารถหยุด Cas9 ได้ ในขณะที่สามารถยอมรับความแตกต่างเบส 3-4 จาก PAM ได้ ดังนั้นตำแหน่งของมันจึงมีความสำคัญพอๆ กับจำนวนความคลาดเคลื่อน
คะแนน/เกณฑ์
ธันวาคม
ความคิดเห็น
ความเฉพาะเจาะจงของเอ็มไอที
0-100
สูง = ความเสี่ยงนอกเป้าหมายเล็กน้อย
CFD (นอกเป้าหมาย)
0-1
ค่าที่สูงกว่า 0.2 สามารถกำจัดได้ในแอปพลิเคชันที่สำคัญ
ตำแหน่งที่ไม่ลงรอยกัน
เมล็ด/ระยะไกล
พื้นที่เมล็ดพันธุ์มีความเสี่ยงมากกว่ามาก
โดยสรุป
- AI ในการออกแบบ CRISPR; แต่เป็นผู้ช่วยที่วางกลยุทธ์ เขียนโค้ด และอธิบายตัวเลือกต่างๆ ไม่ใช่เครื่องมือที่ "สร้าง" gRNA
- ตัวเลือก gRNA ต้องสร้างขึ้นด้วยเครื่องมือพิเศษ (CRISPOR/CHOPCHOP) และ PAM และนอกเป้าหมายจะต้องได้รับการควบคุมด้วยตัวเลข
- คะแนนการออกแบบเป็นการประมาณการ ผลกระทบตามเป้าหมายและนอกเป้าหมายจะต้องได้รับการยืนยันด้วยการทดลอง (การจัดลำดับ)
- การปฏิบัติทางคลินิกและเจิร์มไลน์อยู่ภายใต้ข้อจำกัดด้านจริยธรรม/กฎหมายที่เข้มงวด
งานสมัคร
ดาวน์โหลดขอบเขตยีนเป้าหมายจาก Ensembl เรียกใช้โค้ดการคัดกรองล่วงหน้าของ PAM ด้านบน และระบุรายชื่อโปรโตสเปเซอร์ที่เข้าข่าย จากนั้นส่งออกภูมิภาคเดียวกันไปยังเครื่องมืออย่าง CRISPOR และรับคะแนนตามเป้าหมายและนอกเป้าหมาย เปรียบเทียบผู้สมัครรหัสของคุณกับคำแนะนำของเครื่องมือ ระบุผู้สมัครที่มีความเสี่ยงนอกเป้าหมายสูงสุด และเขียนในหนึ่งประโยคว่าทำไมเขา/เธอถึงถูกคัดออก
รายการตรวจสอบ
- [ ] ฉันแก้ไขเป้าหมายตามยีน เอ็กซอน เวอร์ชันจีโนม และการถอดเสียง
- [ ] ฉันได้รับซีรีส์นี้จากแหล่งที่เชื่อถือได้ ฉันไม่ได้จดจำซีรีส์นี้โดย AI
- [ ] ฉันสร้างและให้คะแนนผู้สมัคร gRNA ด้วยเครื่องมือที่กำหนดเอง
- [ ] ฉันตรวจสอบการมีอยู่ของ PAM และความเสี่ยงนอกเป้าหมาย
- [ ] ฉันจัดทำแผนการตรวจสอบเชิงทดลอง
- [ ] ฉันตระหนักถึงขอบเขตทางจริยธรรม/กฎหมาย และได้รับการอนุมัติจากผู้เชี่ยวชาญ