Faida:
- Uwezo wa kuelewa dhana za CRISPR, gRNA (mwongozo wa RNA), PAM na athari zisizolengwa na kuwa na akili ya bandia hutoa orodha salama ya wagombea wa gRNA na msimbo wa muundo.
- Uwezo wa kuthibitisha binafsi watahiniwa wa gRNA waliopewa na akili bandia na zana za uchanganuzi zisizolengwa na upatanishi wa jenomu.
- Uwezo wa kukubali mipaka ya kimaadili/usalama wa viumbe na kwamba muundo haupaswi kutekelezwa bila uthibitishaji wa kimaabara.
CRISPR-Cas9 (mfumo wa kuhariri jeni uliochukuliwa kutoka kwa bakteria hadi kukata na kuhariri DNA katika sehemu inayolengwa) imebadilisha biolojia ya molekuli: sasa inawezekana kubadilisha kwa usahihi nukta maalum katika jeni. Lakini nguvu hii haina huruma dhidi ya hitilafu za muundo: mwongozo uliochaguliwa kimakosa wa RNA (gRNA - mfuatano mfupi wa RNA unaoelekeza kimeng'enya cha Cas kwa lengo) unaweza kukata jeni isiyo sahihi au kufanya miketo isiyotarajiwa isifikie lengwa. Katika kitengo hiki, utajifunza jinsi ya kutumia akili bandia (AI) kama msaidizi katika muundo wa CRISPR, kuunda mpango, kuandika msimbo, na kuelezea chaguzi; lakini utajifunza kwa nini unahitaji kuthibitisha uteuzi wa gRNA na uchanganuzi usiolengwa kwa zana maalum na kwa majaribio.
Onyo muhimu: Usiulize moja kwa moja AI \ "nipe mlolongo wa gRNA wa jeni hili" na usitumie mlolongo unaoingia jinsi ulivyo. LLM inaweza kutoa gRNA ambayo hailingani na kanuni ya PAM (hapa chini) au inayolingana na kwingineko kwenye jenomu, au hata gRNA iliyoundwa kabisa. Njia sahihi: Kuanzisha mkakati wa usanifu na AI, kuzalisha na kupata wagombeaji kwa zana maalum za kubuni za CRISPR (kama vile CRISPOR, CHOPCHOP) na kuzithibitisha kwa majaribio.
Dhana za kimsingi
- Cas9: Kimeng'enya (mkasi wa molekuli) unaokata DNA. Inaunda mapumziko ya nyuzi mbili ambapo gRNA inaelekeza.
- gRNA / sgRNA: Mwongozo wa takriban nyukleotidi 20 unaolingana na DNA lengwa na husafirisha Cas9 huko.
- PAM (Protospacer Adjacent Motif): Mfuatano mfupi ambao lazima uwe karibu kabisa na lengo la Cas9 ili kukata. Kwa SpCas9 kawaida "NGG" (N ni msingi wowote).
- Ufanisi unaolengwa: jinsi gRNA inavyopunguza kwa ufanisi kwenye lengo (inayopimwa kwa alama ya utabiri).
- Isiyolengwa: gRNA hufunga na kukata pointi nyingine katika jenomu zinazofanana na lengo; zisizohitajika na hatari.
- HDR / NHEJ: Njia za kutengeneza seli baada ya kukatwa; NHEJ kwa ujumla huacha indels ndogo, HDR hufanya mabadiliko sahihi kwenye kiolezo.
Hatua kwa hatua: Mtiririko wa muundo wa CRISPR unaosaidiwa na AI
1. Fafanua lengo na kusudi. Jeni gani, exon ipi, aina gani ya mabadiliko (knockout au usahihishaji wa usahihi)? Toleo la jenomu salama na nakala.
2. Pata mfululizo kutoka kwa chanzo cha kuaminika. Pakua mpangilio wa eneo lengwa kutoka kwa Ensembl/NCBI; Usifanye AI kuikariri.
3. Tengeneza wagombeaji wa gRNA kwa zana maalum. Zana kama vile CRSPOR/CHOPCHOP huangalia PAM, toa alama za lengwa na utafute malengo ya mbali ya jenomu. Tumia AI kutafsiri matokeo ya zana hizi.
4. Ondoa hatari inayolengwa kwa umakini. Kuondoa wagombea walio na alama za juu zisizolengwa; Thibitisha kwa zana nyingi katika programu muhimu.
5. Panga uthibitisho wa majaribio. Thibitisha kwa majaribio (kufuatana, T7E1, mpangilio wa amplikoni) ikiwa gRNA iliyochaguliwa inapunguza lengo (na kutolengwa). Alama ya muundo ni makadirio, sio uthibitisho.
Kidokezo: Kabla ya kutumia kiteuliwa cha gRNA, LIpua mlolongo wake dhidi ya jenomu ili kuona ni wapi mbali na lengwa inalingana sawasawa au kwa ukaribu. Hatua hii pekee inaondoa wagombea hatari zaidi ambao hawakulengwa mapema.
kesi tatu ndogo
Kesi ya 1 - gRNA bila PAM. Mwanafunzi mmoja aliuliza AI kwa gRNA kwa jeni na akapokea mlolongo unaofaa wa nyukleotidi 20. Hata hivyo, hapakuwa na NGG PAM karibu na lengo; Kwa hivyo Cas9 haikuweza kukata hapo. Mwanafunzi alipoingia mkoani kwenye CRSPOR, aliona chombo kilipendekeza watahiniwa halali wenye PAM. Ikiwa mlolongo wa AI ulitumiwa, jaribio lingeshindwa kabisa.
Kesi ya 2 - Siri isiyolengwa. Mtafiti mmoja alipenda gRNA ya "ufanisi wa hali ya juu" iliyopendekezwa na AI. Alipoendesha CRSPOR ili kuangalia kama hakulengwa, aligundua kuwa gRNA ililingana na tofauti 1 pekee ya msingi katika jeni nyingine - hatari kubwa ya kutolengwa. Mgombea aliondolewa. Bila uchanganuzi wa nambari isiyolengwa, jeni isiyohitajika inaweza kukatwa.
Kesi ya 3 - Uthibitisho umepata. Maabara moja iliunganisha watahiniwa watatu wa gRNA na kuwapima katika seli; Kwa mpangilio wa amplicon, aligundua kuwa moja tu ilikuwa na zaidi ya 60% ya uhariri (indels), wakati zingine mbili zilikuwa na chini ya 5%. Alama za muundo zilionyesha zote tatu kama "nzuri". Uthibitishaji wa majaribio ulionyesha tofauti kati ya utabiri na ukweli.
Mfano: Udhibiti wa PAM wa gRNA ya mgombea
agiza re# Pata mpangilio wa eneo lengwa kutoka kwa Ensembl/NCBI; Usifanye AI kukariri. target = "GACGTTGCATCGGATCCTAAGGCTTACGGTAGCTAGCTAGGCTAAGG"# 20 nt protospacer + NGG PAM tafuta SpCas9 (end strand + strand) kwa m in re.finditer(r"(?=([ACGT]{20})([ACGT]GG):mlengo wa kikundi) m2(progroup):m2,m2 kundi)", ([ACGT]GG) lengwa)" , (? chapa(f"Nafasi {m.start()+1}: gRNA={protospacer} PAM={pam}")
Hii itaorodhesha wagombeaji walio na PAM halali pekee; Lakini zana maalum zinahitajika kwa shughuli inayolengwa na isiyolengwa. Nambari hii ni zana ya uchunguzi wa awali, sio muundo kamili.
Violezo vinne vinavyoweza kunakiliwa
1) Mkakati wa kubuni (bila kutoa mfululizo):
Jukumu lako: Msaidizi wa muundo wa CRISPR. Anzisha mkakati wa usanifu wa:[gene, exon, knockout/usahihishaji sahihi, toleo la jenomu, nakala].Ni zana gani mahususi (CRISPOR/CHOPCHOP) iliyo na mipangilio gani ninafaa kutumia, ambayo itaweka alama (juu ya lengo, isiyolengwa) nikitazama, niambie hatua kwa hatua. Inazalisha mlolongo wa gRNA SEN; Nitaizalisha kutoka kwa gari.
2) Tafsiri isiyolengwa:
Eleza jinsi ninavyopaswa kusoma safuwima zisizolengwa kwenye matokeo ya CRSPOR: alama ya MIT, alama ya CFD, hesabu isiyolingana inamaanisha nini, ni kwa vizingiti gani ninapaswa kumuondoa mgombea? Je, vizingiti ni tofauti katika maombi ya kimatibabu na utafiti?
3) Mpango wa uthibitishaji wa majaribio:
Je, ninawezaje kuthibitisha kwa majaribio kwamba gRNA niliyochagua kupunguzwa kwa lengo na hailengi? T7E1, eleza mpangilio wa amplicon (ndani) na udhibiti wa muundo hatua kwa hatua, ikijumuisha vidhibiti vipi vya kuweka.
4) Msimbo wa kuhitimu wa PAM/mfumo:
Andika msimbo wa Python ambao hupata protospacers zote 20 za wagombea wa SpCas9 (NGG PAM) kwenye nyuzi zote mbili katika mlolongo wa lengwa uliotolewa. Ripoti eneo, mazungumzo na PAM kwa kila mgombea. Bainisha katika maoni ya msimbo kwamba hii ni uondoaji wa awali tu na kwamba zana maalum inahitajika kwa ajili ya kutolengwa.
Mwongozo dhaifu / Mwongozo thabiti
Dhaifu: "Nipe mlolongo wa CRISPR gRNA kwa jeni la MYC."
Tatizo: Hakuna toleo la jenomu/manukuu, hakuna PAM na udhibiti usiolengwa, AI inaweza kutoa mlolongo bandia au hatari.
Imara: "Weka mkakati wa usanifu wa CRISPR wa GRCh38, MYC (exon 2) kugonga; niambie ni zana gani nitumie, kwa mpangilio upi, na niondoe kizingiti gani kisicholengwa. Nitazalisha mfuatano wa gRNA kutoka kwa zana; hutazalisha."
Kwa nini ina nguvu: Muktadha uko wazi, muundo umeachwa kwa zana mahususi, isiyolengwa na uthibitishaji umewekwa katikati.
Jukwaa
Jukumu la AI
Uthibitishaji wa lazima
Mkakati
Inapendekeza mipango na zana
Mapitio ya wataalam
uzalishaji wa gRNA
Maoni
Alama ya CRSPOR/CHOPCHOP
Udhibiti wa PAM
anaandika kanuni
Endesha msimbo na uthibitishe
Nje ya lengo
inatangaza alama
Gari maalum + BLAST
Hitimisho
Maoni
Mpangilio wa majaribio
Makosa ya kawaida
- Moja kwa moja kwa kutumia gRNA iliyotolewa na AI. Inaweza kuwa isiyo na PAM, isiyolengwa au bandia.
- Kuruka uchambuzi usiolengwa. Makosa hatari zaidi; jeni zisizohitajika zinaweza kukatwa.
- Kupotosha alama ya muundo kwa ushahidi wa kijaribio. Alama ni utabiri; lazima ithibitishwe kwenye seli.
- Inaacha toleo la jenomu/manukuu bila kubainishwa. Exon isiyo sahihi inaweza kulengwa.
- Kutegemea gari moja. Katika programu muhimu, uthibitisho na zana nyingi unahitajika.
Tahadhari: Uhariri wa jeni kwa madhumuni ya kibinadamu au ya kimatibabu unategemea kanuni nzito za kimaadili na kisheria. Kitengo hiki ni cha utafiti na ubunifu wa kusoma na kuandika; Maamuzi ya mazoezi ya kliniki yanahitaji idhini ya kamati ya maadili, timu ya wataalamu na sheria. Uhariri wa Germline (kurithiwa) umepigwa marufuku katika nchi nyingi.
Kina: soma alama zisizolengwa kwa nambari
Tathmini hatari isiyolengwa kwa alama mbili thabiti, si maneno yasiyoeleweka kama "juu/chini." Alama ya MIT (0-100) ni muhtasari wa jinsi gRNA ilivyo kwa upana wa genome; Alama ya juu (k.m. 80+) inamaanisha hatari ndogo isiyolengwa. Alama ya CFD (Cutting Frequency Determination, 0-1) inakadiria uwezekano wa kukata kila eneo lisilolengwa moja baada ya jingine; Hata eneo moja lisilolengwa zaidi ya 0.2 linaweza kuondoa mgombeaji kwa programu muhimu. Acha akili ya bandia ieleze alama hizi mbili, na kisha usome maadili halisi kwenye pato la gari mwenyewe.
Mfano halisi: timu ilikuwa ikichagua kati ya wagombea wawili. Mgombea A alikuwa na alama ya MIT ya 91 na lengo la juu zaidi la CFD lilikuwa 0.05. Mgombea B alikuwa na alama ya MIT ya 88 lakini alikuwa na lengo moja la nje katika exon ya jeni ya kukandamiza tumor na CFD ya 0.34. Ingawa matokeo ya jumla yalionekana karibu, ambapo walengwa walikuwa (kusimba jeni muhimu kiutendaji) kulifanya Mtahiniwa B asikubalike. Ni muhimu kutathmini lengo la mbali sio tu kwa suala la idadi lakini pia na umuhimu wa kibayolojia wa jeni inayoangukia.
Jambo lingine: ni hatari zaidi kwa kutolingana kutokea katika eneo la "mbegu" karibu na PAM kuliko eneo la mbali; Hata tofauti ya msingi ya 1-2 katika eneo la mbegu inaweza kuacha Cas9, wakati tofauti ya msingi 3-4 mbali na PAM inaweza kuvumiliwa. Kwa hivyo, eneo lake ni muhimu kama idadi ya tofauti.
Alama/kigezo
Desemba
Maoni
Umaalumu wa MIT
0-100
Juu = hatari kidogo isiyolengwa
CFD (lengo lisilolengwa)
0-1
Zaidi ya 0.2 inaweza kuondolewa katika programu muhimu
Msimamo wa kutofautiana
mbegu/mbali
Eneo la mbegu ni hatari zaidi
Kwa muhtasari
- AI katika muundo wa CRISPR; ni msaidizi anayepanga mikakati, kuandika msimbo, na kueleza chaguo, si zana "inayozalisha" gRNA.
- Waombaji wa gRNA lazima watayarishwe kwa zana maalum (CRSPOR/CHOPCHOP), na PAM na walengwa lazima udhibitiwe kwa nambari.
- Alama ya kubuni ni makadirio; Athari inayolengwa na isiyolengwa lazima idhibitishwe kwa majaribio (kufuatana).
- Mbinu za kimatibabu na za vijidudu ziko chini ya mipaka mikubwa ya kimaadili/kisheria.
Jukumu la maombi
Pakua eneo la jeni lengwa kutoka kwa Ensembl. Tekeleza msimbo wa uchunguzi wa awali wa PAM hapo juu na uorodheshe watahiniwa wa protospace. Kisha hamisha eneo lile lile kwa zana kama CRISPOR na upate alama zinazolengwa na zisizolengwa; Linganisha wagombeaji wa misimbo yako na mapendekezo ya zana. Tambua mtahiniwa aliye na hatari kubwa zaidi ya kutolengwa na uandike kwa sentensi moja kwa nini ataondolewa.
orodha ya ukaguzi
- [ ] Niliweka lengo kwa kutumia jeni, exon, toleo la jenomu na nakala.
- [ ] Nilipata mfululizo kutoka kwa chanzo kinachotegemewa, sikuikariri na AI.
- [ ] Nilitengeneza na kufunga watahiniwa wa gRNA kwa zana maalum.
- [ ] Nilikagua uwepo wa PAM na hatari isiyolengwa.
- [ ] Nilianzisha mpango wa uthibitishaji wa majaribio.
- [ ] Ninafahamu mipaka ya kimaadili/kisheria na nimeona uidhinishaji wa wataalamu.