Подршка ЦРИСПР дизајну: одабир гРНА, ефекат ван циља и експериментална валидација

Добици:

• Способност разумевања концепата ЦРИСПР-а, гРНК (водеће РНК), ПАМ-а и ефеката ван циља и вештачке интелигенције производи безбедну листу кандидата за гРНК и код дизајна
• Способност да се лично верификују гРНА кандидати које даје вештачка интелигенција са стручним алатима за анализу ван циља и поравнањем генома
• Способност прихватања етичких/биобезбедносних ограничења и да дизајн не треба да се имплементира без лабораторијске верификације

ЦРИСПР-Цас9 (систем за уређивање гена прилагођен од бактерија за сечење и уређивање ДНК на циљаној тачки) је трансформисао молекуларну биологију: сада је могуће прецизно променити одређену тачку у гену. Али ова моћ је немилосрдна према грешкама у дизајну: погрешно одабрана водећи РНК (гРНА — кратка секвенца РНК која усмерава Цас ензим ка мети) може да пресече погрешан ген или да ненамерно пресече циљ. У овој јединици ћете научити како да користите вештачку интелигенцију (АИ) као помоћника у ЦРИСПР дизајну, креирању плана, писању кода и објашњавању опција; али ћете научити зашто треба да потврдите селекцију гРНК и анализу ван циља помоћу специјализованих алата и експериментално.

Критично упозорење: Немојте директно тражити од АИ „дајте ми гРНК секвенцу за овај ген“ и немојте користити долазну секвенцу каква јесте. ЛЛМ може дати гРНК која се не поклапа са правилом ПАМ (испод) или која се поклапа на другом месту у геному, или чак потпуно направљену гРНК. Прави начин: Успостављање стратегије дизајна помоћу вештачке интелигенције, генерисање и бодовање кандидата помоћу специјалних ЦРИСПР алата за дизајн (као што су ЦРИСПОР, ЦХОПЦХОП) и њихова експериментална верификација.

Основни појмови

• Цас9: Ензим (молекуларне маказе) који сече ДНК. То ствара прекид двоструког ланца где гРНК усмерава.
• гРНА / сгРНА: Водич од приближно 20 нуклеотида који одговара циљној ДНК и тамо преноси Цас9.
• ПАМ (Протоспацер суседни мотив): Кратка секвенца која се мора налазити одмах поред мете да би Цас9 могао да сече. За СпЦас9 обично "НГГ" (Н је било која база).
• Ефикасност на мети: колико ефикасно гРНК сече на мети (мерено резултатом предвиђања).
• Ван циља: гРНА везује и сече друге тачке у геному које личе на мету; непожељно и опасно.
• ХДР / НХЕЈ: Путеви поправке ћелија након сечења; НХЕЈ углавном оставља мале инделе, ХДР прави прецизне промене у шаблону.

Корак по корак: ЦРИСПР ток дизајна уз помоћ вештачке интелигенције

1. Појасните циљ и сврху. Који ген, који егзон, која врста промене (нокаут или прецизна корекција)? Сигурна верзија генома и транскрипт.

2. Набавите серију из поузданог извора. Преузмите секвенцу циљног региона са Енсембл/НЦБИ; Не терајте АИ да га запамти.

3. Генеришите гРНА кандидате помоћу прилагођеног алата. Алати као што је ЦРИСПОР/ЦХОПЦХОП проверавају ПАМ, обезбеђују резултате на мети и траже ван-циљеве у целом геному. Користите вештачку интелигенцију за тумачење резултата ових алата.

4. Озбиљно схватите ризик ван циља. Елиминишите кандидате са високим резултатом ван циља; Потврдите са више алата у критичним апликацијама.

5. Планирајте експерименталну валидацију. Потврдите експериментом (секвенционисање, Т7Е1, секвенцирање ампликона) да ли изабрана гРНК заиста пресеца циљ (и ван циља). Оцена дизајна је процена, а не доказ.

Савет: Пре употребе кандидата за гРНК, БЛАСТ његову секвенцу у односу на геном да видите где се осим циља тачно или блиско подудара. Сам овај корак рано елиминише најопасније кандидате ван циља.

три мини кофера

Случај 1 — гРНА без ПАМ. Један студент је тражио од АИ гРНК за ген и добио разумну секвенцу од 20 нуклеотида. Међутим, није било НГГ ПАМ близу мете; Тако да Цас9 није могао да пресече тамо. Када је студент ушао у регион у ЦРИСПОР, видео је да алат предлаже валидне кандидате са ПАМ-ом. Ако се користи секвенца АИ, експеримент би потпуно пропао.

Случај 2 — Тајно ван циља. Једном истраживачу се допала „високоефикасна“ гРНА коју је предложила АИ. Када је покренуо ЦРИСПОР да провери да ли није циљ, открио је да се гРНК подудара са само 1 базном разликом у другом гену - озбиљан ризик ван циља. Кандидат је елиминисан. Без нумеричке анализе ван циља, нежељени ген би могао бити изрезан.

Случај 3 — Потврда добијена. Једна лабораторија је синтетизовала три кандидата за гРНК и тестирала их у ћелијама; Секвенционисањем ампликона открио је да само један има преко 60% едитовања (индели), док су друга два имала испод 5%. Оцене дизајна су све три показале као „добре“. Експериментална верификација открила је разлику између предвиђања и стварности.

Пример: ПАМ контрола гРНК кандидата

импорт ре# Добити секвенцу циљног региона из Енсембл/НЦБИ; Немојте терати АИ да то запамти. таргет = "ГАЦГТТГЦАТЦГГАТЦЦТААГГЦТТАЦГГТАГЦТАГЦТАГГЦТААГГ"# 20 нт протоспацер + НГГ ПАМ претрага за СпЦас9 (крајњи низ + ланац)за м у ре.финдитер(р"(?=([АЦГТ]{20})([АЦГТ]ГЦТААГГ):([АЦГТ]ГГГ)", пагро промак. м.гроуп(2) принт(ф"Позиција {м.старт()+1}: гРНА={протоспацер} ПАМ={пам}")

Ово ће навести само кандидате са важећим ПАМ-ом; Али посебни алати су потребни за активности на мети и ван циља. Овај код је прелиминарни алат за скрининг, а не комплетан дизајн.

Четири шаблона за копирање

1) Стратегија дизајна (без производње серије):

Ваша улога: ЦРИСПР дизајнерски асистент. Успоставите стратегију дизајна за: [ген, егзон, нокаут/прецизну корекцију, верзију генома, транскрипт]. Који конкретан алат (ЦРИСПОР/ЦХОПЦХОП) са којим подешавањима треба да користим, које резултате (на мети, ван циља) треба да погледам, реците ми корак по корак. Генерисање гРНК секвенце СЕН; Ја ћу га произвести из возила.

2) Тумачење ван циља:

Објасните како треба да читам колоне ван циља у ЦРИСПОР излазу: шта значе МИТ резултат, ЦФД резултат, број неусклађености, на којим праговима треба да елиминишем кандидата? Да ли се прагови разликују у клиничким и истраживачким апликацијама?

3) План експерименталне верификације:

Како могу експериментално да проверим да ли гРНК коју сам одабрао сече на мети и да не прелази циљ? Т7Е1, објасните ампликонско (дубоко) секвенцирање и дизајн контроле корак по корак, укључујући и које контроле треба ставити.

4) ПАМ/фрамеворк предквалификациони код:

Напишите Питхон код који проналази свих 20 нт кандидата протоспацера за СпЦас9 (НГГ ПАМ) на оба ланца у датој циљној секвенци. Пријавите локацију, нит и ПАМ за сваког кандидата. У коментару кода наведите да је ово само прелиминарна елиминација и да је потребан посебан алат за изван циља.

Слаби промпт / Јаки промпт

Слабо: „Дај ми ЦРИСПР гРНА секвенцу за МИЦ ген.“

Проблем: Нема верзије/транскрипта генома, нема ПАМ и контроле ван циља, АИ може дати лажну или опасну секвенцу.

Снажан: „Подесите ЦРИСПР стратегију дизајна за ГРЦх38, МИЦ (егзон 2) нокаут; реците ми који алат да користим, са којим подешавањем и на ком прагу ван циља да елиминишем. Ја ћу произвести гРНК секвенцу из алата; ви је не производите.“

Зашто је моћан: Контекст је јасан, дизајн је препуштен специфичном алату, ван циља и верификација су стављени у центар.

Стаге

Улога АИ

Обавезна верификација

Стратегија

Предлаже планове и алате

Рецензије стручњака

производња гРНК

Коментари

ЦРИСПОР/ЦХОПЦХОП резултат

ПАМ контрола

пише код

Покрените код и потврдите

Ван циља

објављује резултат

Специјално возило + БЛАСТ

Закључак

Коментари

Експериментално секвенцирање

Уобичајене грешке

• Директно користећи гРНК коју даје АИ. Може бити без ПАМ-а, ван циља или лажно.
• Прескакање анализе ван циља. Најопаснија грешка; нежељени гени се могу исећи.
• Погрешити резултат дизајна за емпиријски доказ. Резултат је предвиђање; мора бити верификован у ћелији.
• Остављајући верзију/транскрипт генома неодређеним. Погрешан егзон може бити мета.
• Ослањајући се на једно возило. У критичним апликацијама потребна је потврда са више алата.

Опрез: Уређивање гена за људске или клиничке сврхе подлеже строгим етичким и законским прописима. Ова јединица је за истраживачку и дизајнерску писменост; Одлуке о клиничкој пракси захтевају одобрење етичког комитета, стручни тим и законодавство. Уређивање заметне линије (наслеђено) је забрањено у многим земљама.

Дубина: нумерички читајте резултате ван циља

Процените ризик ван циља помоћу два конкретна резултата, а не нејасних речи попут „високо/ниско“. МИТ скор (0-100) сумира колико је гРНК специфична за читав геном; Висок резултат (нпр. 80+) значи мањи ризик ван циља. ЦФД скор (Одређивање учесталости резања, 0-1) процењује вероватноћу стварног пресецања сваке области ван циљане једне по једне; Чак и један регион ван циља изнад 0,2 може елиминисати кандидата за критичне апликације. Нека вештачка интелигенција објасни ова два резултата, а затим сами прочитајте стварне вредности у излазу возила.

Конкретан пример: тим је бирао између два кандидата. Кандидат А је имао МИТ резултат од 91, а највиши ЦФД ван циља је био 0,05. Кандидат Б је имао МИТ резултат од 88, али је имао само једну изван циља у егзону тумор супресорског гена са ЦФД од 0,34. Иако су се укупни резултати чинили блиски, место где је била ван циља (кодирање функционално критичног гена) учинило је кандидата Б неприхватљивим. Неопходно је проценити не-циљ не само у смислу броја, већ и са биолошке важности гена на који пада.

Још једна ствар: много је ризичније да се неусклађености појаве у "семенском" региону близу ПАМ-а него у удаљеном региону; Чак и разлика од 1-2 базе у региону семена може да заустави Цас9, док се разлика од 3-4 базе даље од ПАМ може толерисати. Стога је његова локација једнако важна као и број неслагања.

Оцена/критеријум

децембар

Коментар

МИТ специфичност

0-100

Висок = мали ризик ван циља

ЦФД (ван циља)

0-1

Изнад 0,2 се може елиминисати у критичним апликацијама

Дисцорд позиција

семе / даљински

Подручје семена је много ризичније

Укратко

• АИ у ЦРИСПР дизајну; то је помоћник који прави стратегију, пише код и објашњава опције, а не алат који „производи“ гРНК.
• Кандидати за гРНА морају бити произведени посебним алатима (ЦРИСПОР/ЦХОПЦХОП), а ПАМ и офф-таргет морају бити нумерички контролисани.
• Оцена дизајна је процена; Ефекат на циљ и ван циља мора бити потврђен експериментално (секвенционисање).
• Клиничке праксе и праксе заметне линије подлежу тешким етичким/правним ограничењима.

Задатак апликације

Преузмите циљни генски регион са Енсембл-а. Покрените ПАМ код претходног скрининга изнад и наведите кандидате за протоспацере. Затим извезите исти регион у алатку као што је ЦРИСПОР и добијете резултате на и ван циља; Упоредите своје кандидате за код са препорукама алата. Идентификујте кандидата са највећим ризиком ван циља и у једној реченици напишите зашто ће он/она бити елиминисан.

контролна листа

• [ ] Поправио сам мету по гену, егзону, верзији генома и транскрипту.
• [ ] Серију сам добио из поузданог извора, нисам је запамтио од стране вештачке интелигенције.
• [ ] Направио сам и постигао гРНК кандидате помоћу прилагођеног алата.
• [ ] Проверио сам присуство ПАМ-а и ризика ван циља.
• [ ] Поставио сам експериментални план верификације.
• [ ] Свестан сам етичких/правних граница и приметио сам стручно одобрење.